Этикетка

Том 13 научных докладов, Номер статьи: 12619 (2023) Цитировать эту статью

568 Доступов

10 Альтметрика

Подробности о метриках

Одной из стратегий борьбы с устойчивостью к противомикробным препаратам является открытие новых классов антибиотиков. Большинство антибиотиков в какой-то момент взаимодействуют с бактериальной мембраной, либо нарушая ее целостность, либо пересекая ее. Поэтому надежные и эффективные инструменты для определения константы диссоциации мембранного связывания (KD) и коэффициента разделения между водной и мембранной фазами (KP) являются важными инструментами для обнаружения и оптимизации антимикробного действия. Здесь мы демонстрируем, что микромасштабный термофорез (MST) можно использовать для измерения KD без меток, используя собственную флуоресценцию триптофана и тем самым устраняя необходимость мечения хромофора. В качестве доказательства принципа мы использовали этот метод для измерения связывания набора небольших циклических АМФ с большими однослойными везикулами (LUV) и двумя типами липидных нанодисков, собранных стирол-малеиновой кислотой (SMA) и четвертичным аммониевым SMA (SMA-QA). ). Измеренные значения KD хорошо коррелируют с соответствующими измерениями с использованием поверхностного плазмонного резонанса (SPR), что также в целом отражает минимальную концентрацию ингибирования (MIC) тестируемых AMP в отношении S. aureus и E. coli. Мы пришли к выводу, что MST является многообещающим методом для быстрого и экономически эффективного обнаружения взаимодействий пептидов и липидов или картирования условий проб при подготовке к более продвинутым исследованиям, которые требуют дорогостоящей подготовки проб, маркировки и/или времени работы с прибором.

Антимикробные пептиды (АМП) привлекают все большее внимание как источник вдохновения для борьбы с надвигающимся кризисом устойчивости к противомикробным препаратам, поскольку открытие новых классов антибиотиков застопорилось1. АМФ представляют собой класс пептидов, обладающих противомикробной активностью, хотя известно, что они также обладают некоторыми противогрибковыми и противораковыми свойствами2,3. Обычно они представляют собой короткие катионные пептиды, состоящие примерно из 12–50 аминокислот, обычно с минимум 4 остатками, необходимыми для активности4. Обнаруженные в большинстве живых организмов, они являются естественными и незаменимыми компонентами врожденной иммунной защиты5,6,7,8. В настоящее время в специализированных хранилищах опубликовано более 20 000 пептидных последовательностей с антимикробными свойствами9,10,11,12,13, что составляет пул потенциальных терапевтических кандидатов. Антимикробный механизм действия большинства АМП, по-видимому, направлен на целостность и/или электрический потенциал бислоя мембраны или имеет несколько мишеней и комбинации способов действия – что-то, что затрудняет развитие резистентности и сопровождается более высокие затраты на поддержание физической формы. За некоторыми исключениями, это контрастирует с традиционными антибиотиками, которые обычно имеют четко определенную цель. Второе преимущество АМФ заключается в том, что нет необходимости полностью пересекать мембрану, поскольку мембраноактивные пептиды часто проявляют свою активность путем разрушения, проницаемости или лизиса самой бактериальной мембраны14,15.

Сродство AMP к бактериальным мембранам часто описывается двумя способами: как событие связывания, которое можно описать с помощью константы диссоциации KD16; или как двухфазная система, где взаимодействие АМФ с липидами рассматривается как разделение между липидной фазой и водной фазой, характеризующееся константой разделения КП17. Таким образом, как KD, так и KP являются полезными дескрипторами для скрининга соединений на основе их взаимодействия с целевой бактериальной мембраной.

Современные методы, используемые для оценки сродства к липидам, обычно имеют ряд недостатков. Они могут быть неприменимы для более сильного связывания (ЯМР)18, требуют маркировки, влияющей на связывание (флуоресцентные анализы)19, отнимают много времени (ЯМР и ППР)20,21, требуют большого количества образцов (ЯМР) или требуют точной настройки для каждого отдельного соединения (SPR и ITC)20,21. Микромасштабный термофорез (МСТ) – метод, лишенный этих недостатков22. Это простой, но мощный инструмент, который позволяет определять параметры связывания путем наблюдения за влиянием связывания на флуорофор и относительными термофоретическими свойствами образующихся комплексов. Связывания получают путем мониторинга изменений интенсивности флуоресценции комплекса с течением времени под воздействием ИК-лазера. Лазер нагревает серию образцов с разной концентрацией лигандов, вызывая перераспределение молекул в соответствии с их относительными энергиями Гиббса в растворе при разных температурах (термофорез). Изменения флуоресценции, обусловленные эффектами связывания лигандов, отслеживаются при нагревании и повторном охлаждении. Метод чувствителен к изменениям складок, формы, сольватной оболочки, заряда или общего размера комплекса, связанного с лигандом. Эти изменения могут влиять на локальное окружение флуорофора, изменяя динамическое и статическое тушение, а также термофоретические свойства комплекса и делая MST чувствительным к потенциально незначительным изменениям свойств, возникающим в результате связывания23. В настоящее время MST в основном используется для оценки биомолекулярных взаимодействий, включая связывание лигандов с различными субстратами22 и полимеризацию24. Предыдущее аналогичное применение MST Yu et al. оценили связывание AMP с использованием FITC-мечения25. MST можно проводить с использованием флуорофорной маркировки или без метки, используя преимущества флуоресцентных аминокислот, таких как W, Y и F. Практически повсеместное распространение W во многих AMP дает возможность изучать свойства связывания AMP напрямую, используя внутреннюю флуоресценцию W. Дополнительными важными преимуществами MST являются низкие требования к образцу, короткое время измерения и простая экспериментальная установка20,21,26.